El diagnòstic de malalties minoritàries (MM) denominades rares, tals com són les malalties
metabòliques hereditàries, és un procés complex que implica una acurada caracterització
clínica i bioquímica dels pacients per encaminar aquest diagnòstic en base d’una sèrie
d’estudis genètics, moleculars i bioquímics.
La seqüenciació ...»»»»
El diagnòstic de malalties minoritàries (MM) denominades rares, tals com són les malalties
metabòliques hereditàries, és un procés complex que implica una acurada caracterització
clínica i bioquímica dels pacients per encaminar aquest diagnòstic en base d’una sèrie
d’estudis genètics, moleculars i bioquímics.
La seqüenciació genètica és una eina primordial en el context del diagnòstic genètic i
molecular de les ja esmentades condicions rares.
Durant els últims 10 anys, la seqüenciació genètica ha esdevingut relativament més fàcil, de
menys cost i considerablement més àgil amb l’aparició de Next Generation Sequencing (NGS).
Mitjançant NGS es poden identificar mutacions que donen lloc a malaltia o que n’atorguen
susceptibilitat.
Els objectius del present treball han estat la validació genètica i funcional de les variants
identificades per Next Generation Sequencing (NGS) en malalties metabòliques hereditàries i
en la malaltia de Parkinson.
En cas de tenir-se molt clar el gen com en el cas dels pacients amb Parkinson, s’ha realitzat
PCR i Sanger establint així el diagnòstic definitiu.
En cas de no tenir aquesta certesa, s’ha procedit a la seqüenciació de l’exoma (part del ADN
que codifica per proteïna) dels pacients, el filtratge de les variants i la validació d’aquestes amb
estudis funcionals.
Aquests estudis funcionals han estat específics de cada cas i han implicat l’ús de mètodes de
biologia molecular (PCR, qPCR, Extracció de ARN, Síntesi de ADNc, western blot, blue native,
activitats enzimàtiques en gel i transfecció) i cel·lular (cultius de fibroblasts de pacients).
A partir dels resultats obtinguts s’han pogut validar funcionalment les mutacions identificades
en els gens FDXR i NDUFS2. D’altre banda s’han descartat les variants presents en els gens
NPHP4 i GMDS.
Pel que fa als pacients amb Parkinson, s’han descartat totes les variants trobades en baixa
cobertura en el gen ATP13A2. Això ens reitera que s’han de comprovar sempre aquelles
variants que es trobin en baixos valors de cobertura en estudis de NGS. D’altre banda, s’ha
trobat una variant en el gen PLA2G6 en el germà d’un dels pacients portadors de la variant.
Aquests diferents estudis ens mostren la importància de l’especificitat d’ aquests en funció de
cada cas. Aquells estudis que han validat les variants ens permeten arribar a un diagnòstic
definitiu.^^^^
The diagnosis of minority diseases (MM) also called rare diseases, such as hereditary metabolic
diseases, is a complex process that involves a careful clinical and biochemical characterisation
of patients to route this diagnosis on the basis of a series of molecular, biochemical and
genetic studies.
The genetic sequencing is ...»»»»
The diagnosis of minority diseases (MM) also called rare diseases, such as hereditary metabolic
diseases, is a complex process that involves a careful clinical and biochemical characterisation
of patients to route this diagnosis on the basis of a series of molecular, biochemical and
genetic studies.
The genetic sequencing is a primordial tool in the context of genetic and molecular diagnosis of
the rare conditions already mentioned.
During the last 10 years, the genetic sequencing has become relatively easier, less expensive
and considerably more agile with the emergence of Next Generation Sequencing (NGS). By
NGS we can identify mutations that give rise to a particular disease or also to its susceptibility.
The objectives of the present study have been the genetic and functional validation of the
variants identified by Next Generation Sequencing (NGS) in hereditary metabolic disorders and
in Parkinson's disease:
In the case in which we had clear the gene, such as in case of Parkinson's disease patients, PCR
and Sanger have been carried on establishing the final diagnosis.
On the other hand, it has been done the exome sequencing (the protein codifying part of the
DNA) of the patients, filtering of the variants and the validation of those with functional
studies.
These functional studies have been specific to each case and have involved the use of methods
of molecular biology (PCR, qPCR, extraction of RNA, synthesis of cDNA, western blot, blue
native, gel enzymatic activities and transfection) and cellular (fibroblasts cultures from
patients).
Based on the results that we obtained, we have been unable to validate functionally identified
mutations in FDXR and NDUFS2 genes. On the other hand, we have discarded the variants in
NPHP4 and GMDS genes.
Relative to patients with Parkinson's disease, we have discarded all the variants found in low
coverage in ATP13A2 gene. This allows us to conclude that it is necessary to validate those
variants that have low values in terms of coverage, since it may not be present in patients. On
the other hand, we have found a variant in PLA2G6 gene on a patient’s brother.
The different studies carried on, show us the importance of the specificity of these, depending
on each case. The studies that have validated the variants, allow us to reach a final diagnosis.^^^^
