Determinació del complex SirT1, SETDB1 i KAP-1 i la seva funcionalitat en la regulació de la cromatina

Abstract

SirT1 és una desacetilasa d’histones depnent de NAD+, és la més estudiada de la família de les Sirtuïnes i s’ha descrit que juga un paper molt important en la regulació de la cromatina. SirT1, interacciona i desacetila el co-repressor de la família de les proteïnes TRIM, KAP-1 regulant així el seu paper en la reparació de DSB. Tanmateix, KAP-1 s’ha vist que forma un complex funcional amb SETDB1, metiltransferasa d’histones, el qual té un paper clau en el silenciament de l’expressió gènica. Ens vàrem plantejar determinar si les tres proteïnes SirT1, KAP-1 i SETDB1 formarien un complex funcional. Amb aquest objectiu, vam determinar l’expressió de SirT1, SETDB1 i KAP-1, prèviament cloandes en vectors d’expressió i les seves interaccions, en condicions normals i sota condicions d’estrès. Finalment, vam estudiar si conformen un complex funcional i quina implicació podria tenir en la regulació de cromatina per co-fraccionament amb FPLC. Els nostres estudis demostren, SirT1 i KAP-1 interaccionen i que aquesta interacció es veu augmentada en condicions d’estrès. També hem vist que la sobre-expressió de SETDB1 provoca una deslocalització de la proteïna al citosol, ja que els seus nivells al nucli estan altament regulats. Tot i que no hem pogut demostrar l’existència d’un complex funcional entre SirT1, SETDB1 i KAP-1, si que hem pogut demostrar que SirT1 i SETDB1 interaccionarien i que aquesta interacció no depèn d’estrès. Addicionalment, hem aconseguit una línia NIH3T3 KO per SirT1, utilitzant la tècnica CRISPR. Els resultats obtinguts ens han permès conèixer les relacions funcionals entre aquestes tres proteïnes i, ens permetrà dissenyar noves estratègies d’estudi en la regulació de la cromatina, en la reparació de danys i en el silenciament dels gens.

SirT1 is a NAD+-dependent histone deacetylase which is the most studied member of Sirtuins family and it has been described as an important regulator of chromatin structure and function. SirT1 interacts and desacetylates the co-repressor of TRIM’s proteins family, KAP-1, regulating his role in DSB repair. Moreover, it has been described that KAP-1 forms together with SETDB1, a histone methyltransferase, a functional complex which has an important role in gene silencing. We have been studied the SirT1, KAP-1 and SETDB1 expression, previously cloned in expression vectors, and their interactions in normal and under oxidative stress conditions. In addition, we studied if these proteins could form a functional complex, involved in chromatin regulation by FPLC co-fractionation. Our studies show that SirT1 and KAP-1 interact and this interaction increases under stress conditions. Moreover, we determined that SETDB1 over-expression causes its cytosolic delocalization, as a result of its highly regulated levels in the nucleus. Although, we could not determine the functional complex between SirT1, SETDB1 and KAP-1 we determine that SirT1 and SETDB1 interact and we observe that this interaction is not stress-dependant. Additionally, we have achieved a NIH3T3 cell line KO for SirT1, using CRISPR technique. All our results allow us to increase our knowledgement about the functional relationship between these 3 proteins and open new strategy to design studies in chromatin regulation, DNA damage repair and gene silencing.